ac⁴C 挑战m1Ψ ？一篇Nature把mRNA修饰核苷带入精细设计时代

本文来自微信公众号： RNAScript ，作者：一一，原文标题：《ac⁴C 挑战 m1Ψ ？一篇Nature把mRNA修饰核苷带入精细设计时代》

自修饰核苷技术，尤其是N¹-甲基假尿苷（m¹Ψ）被规模化用于合成mRNA以来，mRNA疗法在疫苗和蛋白替代等方向取得了快速进展。但随着研究深入，行业也逐渐意识到其中的性能权衡：m¹Ψ可以有效降低外源mRNA的先天免疫原性，却可能改变核糖体读取mRNA的方式，对翻译保真度造成影响，增加移码翻译与提前终止等风险。

近日，由美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NIH/NCI）Shalini Oberdoerffer团队联合约翰斯・霍普金斯大学吴斌、毛海泉等团队合作完成的研究，在Nature正式发表，论文题为《N⁴-Acetylcytidine enhances synthetic mRNA translation yield and fidelity》。这项研究将天然存在的RNA修饰核苷N⁴-乙酰胞苷（ac⁴C）置于治疗性mRNA的设计框架下，与当前产业界广泛应用的N¹-甲基假尿苷（m¹Ψ）展开了系统的头对头比较。

研究结果显示，ac⁴C在体内外模型中均能实现与m¹Ψ相当的免疫抑制效果，同时提升蛋白表达产量，且在报告基因检测体系中展现出更优的翻译保真度。这项工作的核心价值并不止于提供了一种具备潜力的修饰核苷备选方案，更在于它将mRNA修饰核苷的评价体系，从传统的免疫原性、稳定性与蛋白表达量三个维度，进一步延伸至翻译延伸动力学、核糖体碰撞稳态与翻译保真度的深层层面，为下一代高精度mRNA疗法的分子设计提供了新的思路。

行业隐忧：m¹Ψ修饰背后的翻译保真度问题

在当前合成mRNA产业中，修饰核苷的均一掺入已经成为主流设计之一。为避免体外转录（IVT）mRNA通过内吞体途径激活TLR7/TLR8等模式识别受体，进而引发I型干扰素释放与eIF2α磷酸化导致的翻译抑制，m¹Ψ修饰被广泛采用。它支撑了新冠mRNA疫苗的大规模应用，也成为当前mRNA疗法的重要技术基础。

但越来越多的研究显示，这种方案并非只有收益，没有代价。已有研究表明，m¹Ψ在提升表达、降低免疫原性的同时，可能干扰翻译精准度，导致提前终止或核糖体移码错误，进而产生非预期蛋白片段。这一问题在疫苗场景中未必构成同等程度的限制，但在对蛋白表达准确性要求更高的应用场景中，比如蛋白替代疗法、RNA编码抗体、体内细胞治疗或基因编辑工具递送，翻译保真度就会成为更难绕开的安全性问题。

性能验证：ac⁴C在蛋白产量与免疫低反应性上的综合表现

已有研究显示，ac⁴C在编码区（CDS）可通过稳定胞苷与鸟苷的Watson-Crick碱基配对，增强与同源tRNA的相互作用，从而影响翻译延伸过程。

不过，ac⁴C并不是在任何位置都能提升翻译。此前研究提示，如果ac⁴C出现在5′UTR中，可能通过形成结构影响核糖体扫描，抑制翻译起始。因此，这项研究中特意设计了无胞苷（C-less）的5′UTR，将ac⁴C主要限制在编码区内，再与行业主流的m¹Ψ修饰进行系统比较。

1.细胞与无细胞体系：ac⁴C蛋白表达效率更优

在HeLa细胞的NanoLuc荧光素酶报告体系与CD25跨膜受体表达模型中，经递送进入细胞的ac⁴C修饰mRNA表现出更高的蛋白表达水平。在mRNA递送水平和胞内降解动力学相近，甚至RNA水平并不占优的情况下，ac⁴C修饰组的蛋白合成量和细胞表面CD25表达水平均高于m¹Ψ等对照组。

更关键的是，在兔网织红细胞裂解液（RRL）这一无细胞翻译体系中，ac⁴C修饰mRNA仍然支持更持续、更高水平的蛋白合成。这说明ac⁴C的优势并不只是来自免疫抑制或递送差异，而是与翻译机制本身有关。

图1｜ac⁴C修饰mRNA在细胞与无细胞体系中提高蛋白表达。

2.免疫细胞与动物体内：免疫抑制效果相近

过去行业普遍认为，尿苷修饰，尤其是m¹Ψ，是规避内吞体TLR7/8传感器激活的核心路径。但这项研究发现，在对dsRNA和外源RNA高度敏感的原代人单核细胞来源树突状细胞（MoDCs）、THP-1来源巨噬细胞，以及小鼠肝脏体内表达实验中，ac⁴C对IFNB1、TNF和p-eIF2α等免疫激活信号的抑制效果与m¹Ψ接近，部分条件下甚至更低。

图2｜ac⁴C在免疫细胞体内维持低免疫反应并提高表达

进一步机制分析显示，这种免疫低反应性可能与ac⁴C提高mRNA对RNase T2裂解的抵抗有关。换句话说，ac⁴C虽然不是尿苷修饰，却可能通过减少可激活TLR7/8的尿苷富集片段产生，实现与m¹Ψ相近的免疫抑制效果。

小鼠体内实验也强化了这一点。研究者将NanoLuc mRNA包封进LNP，经尾静脉给药至BALB/c小鼠。24小时后，ac⁴C修饰mRNA在肝脏中的生物发光信号约为m¹Ψ的3.5倍，而LNP粒径、包封率和残留mRNA水平均不能解释这一差异。

图3｜ac⁴C在小鼠体内维持低免疫反应并提高表达

这让ac⁴C的价值不再只是细胞层面的表达优势，而是在体内肝脏表达模型中也得到了初步验证。

机制解析：翻译动力学差异是性能分化的核心原因

为什么ac⁴C可以同时带来更高蛋白产量和更好的翻译保真度？

这项研究最重要的贡献，是通过单分子翻译成像、ribosome runoff实验和核糖体足迹测序（Ribo-seq），揭示了不同修饰核苷对翻译延伸动力学的影响，并提出了“修饰位点刹车”（BUMP,Braking Upon Modified Position）模型。

【翻译延伸的微观交通流：BUMP模型对比】

1.未修饰mRNA(Unmodified):

延伸速度：快(⚡⚡⚡)───>极易触发天然免疫传感───>p-eIF2α高表达───>全局翻译被强行锁死终止。

2.m¹Ψ修饰mRNA(Industry Standard):

延伸速度：极慢(⚠严重减速，因P位点Energetically unfavourable C2'-endo构象)

微观表现：后方核糖体高频追尾碰撞(Ribosome Collisions)───>激活核糖体质量控制(RQC)通路───>诱导

+1移码突变(Frameshifting)与杂质抗原释放。

3.ac⁴C修饰mRNA(Next-Gen Solution):

延伸速度：温和减速(🚗线性控速，稳定Watson-Crick碱基配对且不改变核糖体空间几何)

微观表现：核糖体密度合理分布───>彻底避免碰撞堆叠───>高效通畅通过───>维持100%翻译高保真度

这一模型的产业价值在于，它跳出了“修饰核苷=降低免疫原性+提高表达量”的传统理解，提示翻译延伸速度、核糖体碰撞和翻译质量控制，本身就是决定mRNA药物性能的重要变量。

三种状态下的翻译特征，可以这样理解：

未修饰mRNA的翻译延伸速度较快，但容易激活先天免疫通路，引发eIF2α磷酸化，最终抑制整体翻译。它不是核糖体跑不动，而是细胞很快启动了防御反应。

m¹Ψ修饰mRNA的问题则不同。它能有效降低免疫识别，也能招募核糖体，但核糖体在其上移动得更慢。ribosome runoff实验显示，m¹Ψ修饰mRNA的runoff中位时间为13.7分钟，而ac⁴C为6.7分钟，提示m¹Ψ会显著减慢翻译延伸。

翻译不是核糖体越多越好。如果前方核糖体停留时间过长，后方核糖体就会不断追上来，形成碰撞和堆积。研究进一步发现，m¹Ψ修饰mRNA上ZNF598招募增加，提示其更容易触发核糖体碰撞相关的质量控制过程。这样的质量控制一方面可能造成新生肽链降解，损耗有效蛋白产出；另一方面，在特定序列背景下，也可能增加+1移码翻译的发生。

ac⁴C修饰mRNA则呈现出另一种状态。它也会适度影响翻译延伸速度，但没有像m¹Ψ那样造成明显的核糖体堆积。作者认为，ac⁴C通过稳定C-G配对，提高解码效率，同时不明显扰动核糖体几何结构，因此能在降低免疫激活的同时，维持更顺畅的核糖体通行。

换句话说，ac⁴C的价值并不是让核糖体“跑得越快越好”，而是让翻译过程处在更有序、更可控的速度区间内。对治疗性mRNA来说，这种有序性可能比单纯追求高核糖体负载更重要。

图4｜m¹Ψ显著减慢翻译延伸，并增加核糖体碰撞相关质量控制。

产业启示：从“通用修饰”到“场景化选型”

站在产业视角，这项研究的意义并不是否定m¹Ψ的临床价值。

m¹Ψ拥有最成熟的临床验证基础，其安全性和生产经验仍然是目前其他修饰核苷难以替代的。论文作者也明确指出，这项研究并不主张一般性替代m¹Ψ。某些情况下，较慢的翻译延伸甚至可能有助于复杂蛋白的共翻译折叠；在疫苗场景中，适度免疫刺激和抗原表达动力学也未必总是负面因素。

这项工作真正带来的启发是：mRNA修饰核苷的选型逻辑，应当从“单一通用方案”走向“按场景精准适配”。

对疫苗而言，m¹Ψ仍然是经过临床验证的成熟选择。对蛋白替代、基因编辑和体内细胞治疗等方向而言，ac⁴C所提示的“高表达+低免疫激活+高保真度”组合，则更值得继续追踪。

图5｜m¹Ψ显著减慢翻译延伸，并增加核糖体碰撞相关质量控制。

结语：迈向可预测的mRNA分子工程

自然界通过密码子丰度与tRNA配对规则的长期进化，精细平衡着翻译的速度与准确性。而人工合成mRNA的全修饰替代策略，在打破免疫原性瓶颈的同时，也将核糖体置于了进化中从未出现过的环境，带来了新的性能权衡。

ac⁴C的工程化应用价值，不止于提供了一个性能更优的修饰分子，更打开了mRNA药物设计的新维度：我们不仅要关注RNA一维序列的免疫耐受，更要关注翻译过程中核糖体的动态运行状态与稳态维持。

对国内mRNA企业而言，跟进ac⁴C相关的序列设计（如无胞苷UTR匹配）、工业级ac⁴CTP原料合成等方向的技术与专利布局，是未来在国际差异化竞争中构建技术壁垒的重要方向。