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2022-12-05 15:05

我,一只生物狗,用饮水机做了个DNA试验

本文来自微信公众号:iSynBio造物 (ID:gh_1c7f920d8f21),作者:赵杭,原文标题:《我可以用饮水机做PCR吗?》,题图来自:《绝命毒师》


PCR:分子生物学的魔法  


在分子生物学实验中,众多实验工具各有特点:内切酶、连接酶,镂月裁云,移山填海;CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)魔剪,修基因,改序列,神鬼莫测;NGS(Next Generation Sequencing),亿兆片段,并行测序,海量数据,吞天沃日。


但是在我心里,只有一项技术可以称得上魔法二字。空间上,它总齐八荒是其它大部分实验的基础;时间上,它开天辟地把分子生物学划分为不同时代。能配得上魔法二字的,是它是它就是它,生物狗的好朋友——PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)


PCR原理,图源:wikipedia


PCR的发明趣史早已广为流传:


1983年春天的一个晚上,毒瘾不改、好色风流的劣迹化学家凯利·穆利斯(Kary Mullis)开着自己的本田思域前往多西诺。穆利斯在公司里被化学合成DNA的工作打扰得不胜其烦。化学合成DNA实在是太慢了,必须有一种合成DNA的新方法才行。


凯利·穆利斯:你永远不知道我会给你整点什么花活。图源:wikipedia


行驶在128号公路上的他,看着眼前的道路蜿蜒曲折,犹如DNA两条链大开大合,马路牙子好似ATCG碱基配对上下翻飞。穆利斯登时开悟,回去之后几经实验,终于在1983年12月16日,PCR横空出世。


但是,刚发明的PCR反应体系使用的是大肠杆菌的DNA聚合酶。PCR三个主要步骤中的第一步95℃变性足以摧毁反应体系中所有的DNA聚合酶,想要进行下一轮反应就必须打开盖子添加进新的酶,实验几十轮就得添加几十次。中国台湾的科学家钱嘉韵表示:“无所谓,我会出手。”


她早在1976年,就从黄石公园的水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离出了Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶的最佳活性温度为75~80℃,即使在95℃下,半衰期依然超过了40分钟。这种超级耐热的DNA聚合酶仿佛就是为PCR而生的,一次添加,全程耐用,再也不用打开管子一次次加酶了。


终于在1988年,Taq酶被运用在了PCR反应中,一经使用便得到了立竿见影的成功,PCR实验终于可以全程闭管一站到底。Taq酶甚至在1989年赢得了《科学》杂志的“年度最佳分子”奖。其实Taq酶当时被发现后好像也找不到什么实际用处,毕竟谁会在“开水”里面做实验呢。但科学发现有时候就是这样,你以为没用的发现,谁知道多年以后会被别人捡起来用在什么地方。


最终,穆利斯捞到了名声:在1993年被授予了诺贝尔化学奖(一起得奖的是更早之前独立提出PCR原理的Kjell Kleppe)。他任职的公司Cetus公司捞到了钱:奖励了穆利斯1万美金,然后转手将专利权卖给了F. Hoffmann-La Roche,售价三个亿,美元!只有钱嘉韵,既没暴富,也没出名,至今连个维基百科的词条都没有。


但是等等,你以为到这里,就结束了吗?你有没有想过,PCR技术刚发明出来的时候,肯定是没有PCR仪的,当时也还没有耐高温的Taq DNA聚合酶,那他们是怎么做实验的呢?


水浴锅:谁来救救博士生的小手手  


PCR作为实验技术,其原理简洁明了。但对于做实验的人嘛,那就非常的不友好了。高端的实验往往只需要简单的设备,开天辟地的PCR,最开始是在水浴锅里面完成的。


想象一下实验人员面前放了三个水浴锅,分别被调成不同温度。将加好反应体系的EP管放在高温水浴锅里呆30秒,时间一到便把管子从高温水浴锅拿出来放到低温水浴锅,然后低温水浴的时间到了打开盖子补充新的DNA聚合酶,随后盖上盖子再放到中温水浴锅进行延伸,延伸够了再放回高温,低温,开盖子,中温,高温,低温,开盖子,中温……


一个完整的PCR反应通常需要循环几十轮的扩增,PCR体系只不过是换了温度泡了几十次的澡,实验人员的胳膊可是反复横跳几十轮。救命,实验人员的命也是命啊!


古早时期的“PCR仪器”,就是三个温度的水浴锅。水浴锅上贴着“不要开机过夜(please DO NOT leave this machine on overnight)”,这句也算是实验室箴言代代流传了。


Mr. Cycle:傻大黑粗的初代PCR仪,图源:wikipedia


“人肉”PCR太繁琐了,实验人员实在是不堪其苦。


终于,Cetus公司在1985年发明了一种“自动化”的机器完成这项烦人的工作。这台机器被命名为循环先生(Mr. Cycle),结构上包含了一个可以滑动的抽屉用来放PCR的样品,以及几根黑色软管连接着不同温度的热水。需要高温时,热水管打开,滋出来热水对反应体系加热;需要低温时,冷水管打开,滋出来冷水降温。一个循环结束,抽屉滑出来,实验人员打开盖子往管子里面加入新的DNA聚合酶。


第一台自动化PCR仪,图源:wikipedia


第一台真正意义上的自动化PCR仪Mr.Cycle,仪器侧面贴有CaliforniaDreamin的贴纸,可能是在内涵PCR发明人穆里斯爱冲浪。


虽然还没那么智能吧,但Mr. Cycle毕竟也比全程手举着轻松多了,用过的老哥都说好。有用户甚至表示这台古董机器比现今的PCR仪效果更好!现在PCR仪的变温速度大概在6℃/s,而不同温度水浴之间的切换就是一瞬间的事。升温快降温快,引物错配之类的幺蛾子就会少很多。


TC1和Taq:双剑合璧,事半功倍  


Mr. Cycle解决了无需胳膊动的问题,但还是显得傻大黑粗了一些。再加上使用水浴的方式加热,弄得到处湿漉漉的也不方便。1987年, Cetus公司随即推出了第一款商品化的DNA热循环仪——TC1。


左:TC1;右:可能比TC1更早问世的Baby Blue,图源:wikipedia


TC1进行了大刀阔斧的革新:


1. TC1不再使用水浴直接加热样品,而是通过金属模块对样品进行加热和冷却。


2. TC1 的热源也不是热水,而是使用了和冰箱一样的压缩机和电热丝。


3. TC1乘着电子芯片发展的东风,自带温度控制系统,允许用户自由编辑PCR程序。


TC1和Mr. Cycle相比简直脱胎换骨!这里多说几句加热样品的金属模块。一般PCR仪的导热盘是铝做的,虽然导热速率只有 247W/m·K并且氧化之后灰蒙蒙的,但是胜在便宜。可土豪实验室不差钱,为了控温更加精准和迅速,高级的PCR仪器用纯银的导热盘(429 W/m·K)。而再土豪一些的PCR仪为了防止银质导热盘被氧化,更是镀了一层黄金。


有时候我很好奇,世界上有没有纯金的PCR仪导热盘,也让我开开眼?


从左到右的导热盘材料依次是:铝,银,金。图源:wikipedia


1987年11月,世界上第一款包含Taq酶、专用于PCR的试剂盒“GeneAmp”面世。


1988年,科研人员第一次在TC1热循环仪中使用Taq酶。双剑合璧,为PCR在分子生物学研究领域带来一场革命铺平了道路。


其实,你可以用饮水机做PCR


上文说到,TC1这一代的PCR仪,制冷时用的是和冰箱一样的压缩机。可是压缩机这种东西噪音大、体积大、有制冷液容易泄露,最重要的是温度调节不够迅速。如果是冰箱这种恒温制冷尚能应付,对于PCR仪这种需要快速变温的仪器还是差点意思。


最终解决的方法靠的是法国科学家珀耳帖在1834年发现的珀耳帖效应(Peltier effect):当有电流通过不同的导体组成的回路时,除产生不可逆的焦耳热外,在不同导体的接头处随着电流方向的不同会分别出现吸热、放热现象。


珀耳帖效应大致的原理是这样:


珀耳帖效应原理示意图,图源:wikipedia


当用不同电阻的材料构成一个电路时,带电粒子原先在电阻小的导体中能级很高,飞速运行,遇到电阻大的导体“Duang”的一下撞了上去,原先携带的一部分能量就会以热量的散发出去,因此两个材料的交界处会产生额外的热量。


当带电粒子用力挣脱电阻较大的导体时,要从环境中额外吸收能量才能恢复原先的高能级量状态,因此两个材料的交界处会被吸走热量,表现为温度降低。


最最精妙的是,此时如果把电流反过来,原先吸热的位置会放热,原先放热的位置则会吸热。


半导体制冷原件示意图,图源:wikipedia


根据珀耳帖效应设计出的半导体制冷模块静音、寿命长、不易泄漏、体积小、形状灵活。只要改变电流方向,既可以加热又可以冷却,温控还十分精确和方便。


虽然半导体制冷模块能耗高了些,但是对于小电器来说妥妥的够用。除了工业中的精密仪器,生活里的车载小冰箱、制冷饮水机都是用的半导体制冷。


由于以上优点,半导体制冷取代了压缩机成为目前所有PCR仪的控温模块,包括你实验室的PCR仪。所以下次做实验如果PCR仪坏了,你或许可以考虑魔改一下饮水机做PCR?


热盖:退退退,我才是最后一环  


PCR仪进化到这一步仍没结束。由于PCR反应涉及到高低温的转换,因此总会有一部分反应体系中的水,蒸发后凝结到管壁或者管盖上,体系的体积越来越小,反应越来越困难,这肯定不行。


最初研究者的解决方法是在PCR体系中加入一些矿物油,这样油层浮在上层,底下的水溶液即使蒸发也无路可逃(这个方法在PCR中已经淘汰但是在一些特殊实验中仍被在使用)


后来又有人想到给整个管子内部都涂上疏水材料,这样即使水汽遇到管壁凝结,最后仍能流回反应体系。


可无论是矿物油还是疏水层,一方面会增加实验难度;另一方面这些材料可能混入PCR体系而对反应产生干扰,并且污染样品。这两个解决方法都不完美。


上世纪90年代,热盖技术出现。热盖可以把PCR管的顶部加热到超过100℃。盖子比PCR体系还热,水蒸汽即使上来也无法凝结,只能再乖乖回去。妙,实在是妙。


至此,PCR仪的究极进化体终于完成。


热盖原理和现代PCR仪结构,图源:wikipedia


从PCR技术和PCR仪的发展历程来看,实验技术和实验仪器的发展往往是反着来的。PCR仪从水浴锅逐渐变成我们认不出的“高大上”样子,但是这大大降低了技术的门槛,使得PCR这个实验越来越简单。旧时王谢堂前燕,飞入寻常百姓家。PCR和PCR仪在每个实验室安了家,扎下根,成为了夫妻和睦、居家旅行、教育孩子之必备神技,开启了属于它的魔法时代。


造物有话说:穆利斯当年诺奖级的工作准备投两篇论文,第一篇因为他自己拖延,虽然发在了Science却只排第四作者。另一篇虽然是一作却因为拖拉太久只能投个三流期刊。所以,各位导师们,请加大催论文的力度吧。反正我早就毕业了……


参考文献:

1.https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

2.https://en.wikipedia.org/wiki/Thermal_cycler

3.https://en.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullis

4.https://americanhistory.si.edu/collections/search/object/nmah_1000862

5.http://enseqlopedia.com/2012/10/how-old-can-a-pcr-machine-be-whilst-still-being-useful/

6.https://bitesizebio.com/13505/the-invention-of-pcr/

7.https://slideplayer.com/slide/17710558/

8.https://www.sigmaaldrich.com/HK/zh/product/sigma/m8662

9.https://thebumblingbiochemist.com/365-days-of-science/hot-start-pcr-10.heated-lids-polymerase-options-etc-basically-some-random-pcr-stuff-to-get-the-best-chance-at-a-successful-pcr-experiment/

11.https://certsci.com/scientific-instruments/dna-instruments-parts-accessories/pcr-real-time-pcr-parts-accessories/9700-pcr/9700-pcr-96-well-silver-block/

12.https://profcontrol.de/Applied-Biosystems-ABI-9700-GeneAmp-96Well-Gold-plated-Silver-Block-Thermocycler

13.https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-thermal-cyclers/pcr-thermal-cyclers-overview.html

14.https://www.thermofisher.cn/blog/behindthebench/30-years-of-thermal-cycler-innovations-1-the-worlds-first-thermal-cycler-and-how-it-advanced-science/

15.https://www.the-scientist.com/foundations-old/mr-cycle-an-automated-pcr-prototype-47003

16.https://www.thermofisher.cn/blog/behindthebench/30-years-of-thermal-cycler-innovations-2-paving-the-way-for-whole-genome-sequencing-and-other-amazing-scientific-discoveries/

17.https://slideplayer.com/slide/4685436/

18.https://www.technologynetworks.com/analysis/articles/qpcr-analysis-how-a-qpcr-machine-works-and-qpcr-protocol-356835

19.https://www.thelabworldgroup.com/blog/all-about-standard-pcr/

20.https://www.bilibili.com/video/BV14U4y1N7Y6/?vd_source=114d9dc84f2014a07a132105ab7ea3c9

21.https://global.kyocera.com/prdct/ecd/peltier/

22.https://zhongce.sina.com.cn/article/view/122048/


本文来自微信公众号:iSynBio造物 (ID:gh_1c7f920d8f21),作者:赵杭

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