我，一只生物狗，用饮水机做了个DNA试验

本文来自微信公众号：iSynBio造物 （ID：gh_1c7f920d8f21），作者：赵杭，原文标题：《我可以用饮水机做PCR吗？》，题图来自：《绝命毒师》

PCR：分子生物学的魔法  

在分子生物学实验中，众多实验工具各有特点：内切酶、连接酶，镂月裁云，移山填海；CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）魔剪，修基因，改序列，神鬼莫测；NGS（Next Generation Sequencing），亿兆片段，并行测序，海量数据，吞天沃日。

但是在我心里，只有一项技术可以称得上魔法二字。空间上，它总齐八荒是其它大部分实验的基础；时间上，它开天辟地把分子生物学划分为不同时代。能配得上魔法二字的，是它是它就是它，生物狗的好朋友——PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）。

PCR原理，图源：wikipedia

PCR的发明趣史早已广为流传：

1983年春天的一个晚上，毒瘾不改、好色风流的劣迹化学家凯利·穆利斯（Kary Mullis）开着自己的本田思域前往多西诺。穆利斯在公司里被化学合成DNA的工作打扰得不胜其烦。化学合成DNA实在是太慢了，必须有一种合成DNA的新方法才行。

凯利·穆利斯：你永远不知道我会给你整点什么花活。图源：wikipedia

行驶在128号公路上的他，看着眼前的道路蜿蜒曲折，犹如DNA两条链大开大合，马路牙子好似ATCG碱基配对上下翻飞。穆利斯登时开悟，回去之后几经实验，终于在1983年12月16日，PCR横空出世。

但是，刚发明的PCR反应体系使用的是大肠杆菌的DNA聚合酶。PCR三个主要步骤中的第一步95℃变性足以摧毁反应体系中所有的DNA聚合酶，想要进行下一轮反应就必须打开盖子添加进新的酶，实验几十轮就得添加几十次。中国台湾的科学家钱嘉韵表示：“无所谓，我会出手。”

她早在1976年，就从黄石公园的水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离出了Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶的最佳活性温度为75～80℃，即使在95℃下，半衰期依然超过了40分钟。这种超级耐热的DNA聚合酶仿佛就是为PCR而生的，一次添加，全程耐用，再也不用打开管子一次次加酶了。

终于在1988年，Taq酶被运用在了PCR反应中，一经使用便得到了立竿见影的成功，PCR实验终于可以全程闭管一站到底。Taq酶甚至在1989年赢得了《科学》杂志的“年度最佳分子”奖。其实Taq酶当时被发现后好像也找不到什么实际用处，毕竟谁会在“开水”里面做实验呢。但科学发现有时候就是这样，你以为没用的发现，谁知道多年以后会被别人捡起来用在什么地方。

最终，穆利斯捞到了名声：在1993年被授予了诺贝尔化学奖（一起得奖的是更早之前独立提出PCR原理的Kjell Kleppe）。他任职的公司Cetus公司捞到了钱：奖励了穆利斯1万美金，然后转手将专利权卖给了F. Hoffmann-La Roche，售价三个亿，美元！只有钱嘉韵，既没暴富，也没出名，至今连个维基百科的词条都没有。

但是等等，你以为到这里，就结束了吗？你有没有想过，PCR技术刚发明出来的时候，肯定是没有PCR仪的，当时也还没有耐高温的Taq DNA聚合酶，那他们是怎么做实验的呢？

水浴锅：谁来救救博士生的小手手  

PCR作为实验技术，其原理简洁明了。但对于做实验的人嘛，那就非常的不友好了。高端的实验往往只需要简单的设备，开天辟地的PCR，最开始是在水浴锅里面完成的。

想象一下实验人员面前放了三个水浴锅，分别被调成不同温度。将加好反应体系的EP管放在高温水浴锅里呆30秒，时间一到便把管子从高温水浴锅拿出来放到低温水浴锅，然后低温水浴的时间到了打开盖子补充新的DNA聚合酶，随后盖上盖子再放到中温水浴锅进行延伸，延伸够了再放回高温，低温，开盖子，中温，高温，低温，开盖子，中温……

一个完整的PCR反应通常需要循环几十轮的扩增，PCR体系只不过是换了温度泡了几十次的澡，实验人员的胳膊可是反复横跳几十轮。救命，实验人员的命也是命啊！

古早时期的“PCR仪器”，就是三个温度的水浴锅。水浴锅上贴着“不要开机过夜（please DO NOT leave this machine on overnight）”，这句也算是实验室箴言代代流传了。

Mr. Cycle：傻大黑粗的初代PCR仪，图源：wikipedia

“人肉”PCR太繁琐了，实验人员实在是不堪其苦。

终于，Cetus公司在1985年发明了一种“自动化”的机器完成这项烦人的工作。这台机器被命名为循环先生（Mr. Cycle），结构上包含了一个可以滑动的抽屉用来放PCR的样品，以及几根黑色软管连接着不同温度的热水。需要高温时，热水管打开，滋出来热水对反应体系加热；需要低温时，冷水管打开，滋出来冷水降温。一个循环结束，抽屉滑出来，实验人员打开盖子往管子里面加入新的DNA聚合酶。

第一台自动化PCR仪，图源：wikipedia

第一台真正意义上的自动化PCR仪Mr.Cycle，仪器侧面贴有CaliforniaDreamin的贴纸，可能是在内涵PCR发明人穆里斯爱冲浪。

虽然还没那么智能吧，但Mr. Cycle毕竟也比全程手举着轻松多了，用过的老哥都说好。有用户甚至表示这台古董机器比现今的PCR仪效果更好！现在PCR仪的变温速度大概在6℃/s，而不同温度水浴之间的切换就是一瞬间的事。升温快降温快，引物错配之类的幺蛾子就会少很多。

TC1和Taq：双剑合璧，事半功倍  

Mr. Cycle解决了无需胳膊动的问题，但还是显得傻大黑粗了一些。再加上使用水浴的方式加热，弄得到处湿漉漉的也不方便。1987年， Cetus公司随即推出了第一款商品化的DNA热循环仪——TC1。

左：TC1；右：可能比TC1更早问世的Baby Blue，图源：wikipedia

TC1进行了大刀阔斧的革新：

1. TC1不再使用水浴直接加热样品，而是通过金属模块对样品进行加热和冷却。

2. TC1 的热源也不是热水，而是使用了和冰箱一样的压缩机和电热丝。

3. TC1乘着电子芯片发展的东风，自带温度控制系统，允许用户自由编辑PCR程序。

TC1和Mr. Cycle相比简直脱胎换骨！这里多说几句加热样品的金属模块。一般PCR仪的导热盘是铝做的，虽然导热速率只有 247W/m·K并且氧化之后灰蒙蒙的，但是胜在便宜。可土豪实验室不差钱，为了控温更加精准和迅速，高级的PCR仪器用纯银的导热盘（429 W/m·K）。而再土豪一些的PCR仪为了防止银质导热盘被氧化，更是镀了一层黄金。

有时候我很好奇，世界上有没有纯金的PCR仪导热盘，也让我开开眼？

从左到右的导热盘材料依次是：铝，银，金。图源：wikipedia

1987年11月，世界上第一款包含Taq酶、专用于PCR的试剂盒“GeneAmp”面世。

1988年，科研人员第一次在TC1热循环仪中使用Taq酶。双剑合璧，为PCR在分子生物学研究领域带来一场革命铺平了道路。

其实，你可以用饮水机做PCR

上文说到，TC1这一代的PCR仪，制冷时用的是和冰箱一样的压缩机。可是压缩机这种东西噪音大、体积大、有制冷液容易泄露，最重要的是温度调节不够迅速。如果是冰箱这种恒温制冷尚能应付，对于PCR仪这种需要快速变温的仪器还是差点意思。

最终解决的方法靠的是法国科学家珀耳帖在1834年发现的珀耳帖效应（Peltier effect）：当有电流通过不同的导体组成的回路时，除产生不可逆的焦耳热外，在不同导体的接头处随着电流方向的不同会分别出现吸热、放热现象。

珀耳帖效应大致的原理是这样：

珀耳帖效应原理示意图，图源：wikipedia

当用不同电阻的材料构成一个电路时，带电粒子原先在电阻小的导体中能级很高，飞速运行，遇到电阻大的导体“Duang”的一下撞了上去，原先携带的一部分能量就会以热量的散发出去，因此两个材料的交界处会产生额外的热量。

当带电粒子用力挣脱电阻较大的导体时，要从环境中额外吸收能量才能恢复原先的高能级量状态，因此两个材料的交界处会被吸走热量，表现为温度降低。

最最精妙的是，此时如果把电流反过来，原先吸热的位置会放热，原先放热的位置则会吸热。

半导体制冷原件示意图，图源：wikipedia

根据珀耳帖效应设计出的半导体制冷模块静音、寿命长、不易泄漏、体积小、形状灵活。只要改变电流方向，既可以加热又可以冷却，温控还十分精确和方便。

虽然半导体制冷模块能耗高了些，但是对于小电器来说妥妥的够用。除了工业中的精密仪器，生活里的车载小冰箱、制冷饮水机都是用的半导体制冷。

由于以上优点，半导体制冷取代了压缩机成为目前所有PCR仪的控温模块，包括你实验室的PCR仪。所以下次做实验如果PCR仪坏了，你或许可以考虑魔改一下饮水机做PCR？

热盖：退退退，我才是最后一环  

PCR仪进化到这一步仍没结束。由于PCR反应涉及到高低温的转换，因此总会有一部分反应体系中的水，蒸发后凝结到管壁或者管盖上，体系的体积越来越小，反应越来越困难，这肯定不行。

最初研究者的解决方法是在PCR体系中加入一些矿物油，这样油层浮在上层，底下的水溶液即使蒸发也无路可逃（这个方法在PCR中已经淘汰但是在一些特殊实验中仍被在使用）。

后来又有人想到给整个管子内部都涂上疏水材料，这样即使水汽遇到管壁凝结，最后仍能流回反应体系。

可无论是矿物油还是疏水层，一方面会增加实验难度；另一方面这些材料可能混入PCR体系而对反应产生干扰，并且污染样品。这两个解决方法都不完美。

上世纪90年代，热盖技术出现。热盖可以把PCR管的顶部加热到超过100℃。盖子比PCR体系还热，水蒸汽即使上来也无法凝结，只能再乖乖回去。妙，实在是妙。

至此，PCR仪的究极进化体终于完成。

热盖原理和现代PCR仪结构，图源：wikipedia

从PCR技术和PCR仪的发展历程来看，实验技术和实验仪器的发展往往是反着来的。PCR仪从水浴锅逐渐变成我们认不出的“高大上”样子，但是这大大降低了技术的门槛，使得PCR这个实验越来越简单。旧时王谢堂前燕，飞入寻常百姓家。PCR和PCR仪在每个实验室安了家，扎下根，成为了夫妻和睦、居家旅行、教育孩子之必备神技，开启了属于它的魔法时代。

造物有话说：穆利斯当年诺奖级的工作准备投两篇论文，第一篇因为他自己拖延，虽然发在了Science却只排第四作者。另一篇虽然是一作却因为拖拉太久只能投个三流期刊。所以，各位导师们，请加大催论文的力度吧。反正我早就毕业了……

参考文献：

1.https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

2.https://en.wikipedia.org/wiki/Thermal_cycler

3.https://en.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullis

4.https://americanhistory.si.edu/collections/search/object/nmah_1000862

5.http://enseqlopedia.com/2012/10/how-old-can-a-pcr-machine-be-whilst-still-being-useful/

6.https://bitesizebio.com/13505/the-invention-of-pcr/

7.https://slideplayer.com/slide/17710558/

8.https://www.sigmaaldrich.com/HK/zh/product/sigma/m8662

9.https://thebumblingbiochemist.com/365-days-of-science/hot-start-pcr-10.heated-lids-polymerase-options-etc-basically-some-random-pcr-stuff-to-get-the-best-chance-at-a-successful-pcr-experiment/

11.https://certsci.com/scientific-instruments/dna-instruments-parts-accessories/pcr-real-time-pcr-parts-accessories/9700-pcr/9700-pcr-96-well-silver-block/

12.https://profcontrol.de/Applied-Biosystems-ABI-9700-GeneAmp-96Well-Gold-plated-Silver-Block-Thermocycler

13.https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-thermal-cyclers/pcr-thermal-cyclers-overview.html

14.https://www.thermofisher.cn/blog/behindthebench/30-years-of-thermal-cycler-innovations-1-the-worlds-first-thermal-cycler-and-how-it-advanced-science/

15.https://www.the-scientist.com/foundations-old/mr-cycle-an-automated-pcr-prototype-47003

16.https://www.thermofisher.cn/blog/behindthebench/30-years-of-thermal-cycler-innovations-2-paving-the-way-for-whole-genome-sequencing-and-other-amazing-scientific-discoveries/

17.https://slideplayer.com/slide/4685436/

18.https://www.technologynetworks.com/analysis/articles/qpcr-analysis-how-a-qpcr-machine-works-and-qpcr-protocol-356835

19.https://www.thelabworldgroup.com/blog/all-about-standard-pcr/

20.https://www.bilibili.com/video/BV14U4y1N7Y6/?vd_source=114d9dc84f2014a07a132105ab7ea3c9

21.https://global.kyocera.com/prdct/ecd/peltier/

22.https://zhongce.sina.com.cn/article/view/122048/

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